事業推進担当者: 土居 信英 (どい のぶひで)

事業推進担当者 | 特別研究教員 | RA・特別研究員

土居 信英 (どい のぶひで)

慶應義塾大学理工学部 准教授

昭和43年生
〒223-8522 横浜市港北区日吉3-14-1
TEL:045-566-1772 /FAX:045-566-1440
E-mail:address:doi@bio.keio.ac.jp
URL:http://www.bio.keio.ac.jp/research/staff/doi.html

資格・学位

1997年3月 博士号取得(北海道大学)

主たる研究領域

分子生物学、プロテオミクス、進化工学、抗体工学、合成生物学

主たる所属学会

日本分子生物学会、日本生物物理学会

COE分担課題と研究活動

In vitro virus(IVV)法によるヒト細胞代謝に関わるタンパク質間ネットワーク解析
 当研究室で開発されたIVV法やタンパク質C末端蛍光ラベル化法などの独自技術(下記参照)を用いて、肝臓・癌・幹細胞などのヒト細胞代謝酵素系のタンパク質間ネットワーク解析とその制御機構の解明に貢献したい。



 ピューロマイシンは、リボソーム上で合成途中のポリペプチドのC末端に結合することでタンパク質合成を阻害する抗生物質である。しかし、アミノアシルtRNAと競合しない低濃度のピューロマイシン存在下で、終止コドン以降を切除したmRNAを鋳型として無細胞翻訳反応を行うと、ほぼ全てのピューロマイシンは全長タンパク質のC末端にのみ結合する。この性質を利用して、タンパク質のC末端に情報タグであるmRNAや蛍光色素を付加する2つの技術をピューロマイシン・テクノロジーと称する(上図)。
 IVV法では、mRNAライブラリーの3'末端にスペーサーを介してピューロマイシンを連結し、無細胞翻訳系に加えることで、合成されたタンパク質(表現型)とmRNA(遺伝子型)とがピューロマイシンを介して共有結合された対応づけ分子(IVV)のライブラリーを調製できる。このライブラリーの中から、標的分子に結合する特定のタンパク質を試験管内選択した後、そのmRNA部分を逆転写PCRで増幅し、塩基配列を解読することで、得られたタンパク質のアミノ酸配列を容易に同定することが可能となる。mRNAディスプレイとも呼ばれる。従来のファージディスプレイと比較して、宿主による制限がないため10の13乗という莫大なサイズのライブラリーを探索することができる。
 C末端ラベル化法では、蛍光色素などを付加したピューロマイシン誘導体とmRNAを同時に無細胞翻訳系に加えることで、合成された全長タンパク質のC末端を蛍光色素などで標識できる。この方法をプロテオームチップや蛍光相関分光法によるタンパク質相互作用の大規模解析に応用することができる。従来の精製タンパク質の化学標識法と比較すると、合成と同時に標識されるので事前のタンパク質精製は不要であり、C末端なので活性を阻害する恐れが少ないという利点がある。

これまでの研究概要

これまで2002年度に採択された21世紀COEプログラム「システム生物学による生命の理解と制御」(生命科学分野)の拠点リーダーであった柳川弘志教授の元で、当研究室で開発されたIVV法やタンパク質C末端ラベル化法、プロテオームチップ、抗体チップなどの新しい手法をゲノム機能解析やプロテオーム解析、ゲノム創薬などに適用する研究を遂行してきた。

主な研究業績

Matsumura, N., Tsuji, T., Sumida, T., Kokubo, M., Onimaru, M., Doi, N., Takashima, H., Miyamoto-Sato, E., Yanagawa, H.: mRNA display selection of a high-affinity, Bcl-XL-specific binding peptide. FASEB J., in press (2010)

Tanaka, J., Doi, N., Takashima, H., Yanagawa, H.: Comparative characterization of random-sequence proteins consisting of 5, 12 and 20 kinds of amino acids. Protein Sci., in press (2010)

Sumida, T., Doi, N., Yanagawa, H.: Bicistronic DNA display for in vitro selection of Fab fragments. Nucleic Acids Res., 37, e147 (2009)

Tsuji, T., Onimaru, M., Doi, N., Miyamoto-Sato, E., Takashima, H., Yanagawa, H.: In vitro selection of GTP-binding proteins by block shuffling of estrogen-receptor fragments. Biochem. Biophys. Res. Commun., 390, 689-693 (2009)

Tabata, N., Sakuma, Y., Honda, Y., Doi, N., Takashima, H., Miyamoto-Sato, E., Yanagawa, H.: Rapid antibody selection by mRNA display on a microfluidic chip. Nucleic Acids Res. 37, e64 (2009)

Horisawa, K., Doi, N., Yanagawa, H.: Use of cDNA tiling arrays for identifying protein-interactions selected by in vitro display technologies. PLoS ONE 3, e1646 (2008)

Nishizaki, T., Tsuge, K., Itaya, M., Doi, N., Yanagawa, H.: Metabolic engineering of carotenoid biosynthesis in Escherichia coli by ordered gene assembly in Bacillus subtilis (OGAB). Appl. Environ. Microbiol. 73, 1355-1361 (2007)

Oishi, Y., Yunomura, S., Kawahashi, Y., Doi, N., Takashima, H., Baba, T., Mori, H., Yanagawa, H.: Escherichia coli proteome chips for detecting protein-protein interactions. Proteomics 6, 6433-6436 (2006)

Fukuda, I., Kojoh, K., Tabata, N., Doi, N., Takashima, H., Miyamoto-Sato, E., Yanagawa, H.: In vitro evolution of single-chain antibodies using mRNA display. Nucleic Acids Res. 34, e127 (2006)

Oyama, R., Takashima, H., Yonezawa, M., Doi, N., Miyamoto-Sato, E., Kinjo, M., Yanagawa, H.: Protein-protein interaction analysis by C-terminally specific fluorescence labeling and fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nucleic Acids Res. 34, e102 (2006)

Tateyama, S., Horisawa, K., Takashima, H., Miyamoto-Sato, E., Doi, N., Yanagawa, H.: Affinity selection of DNA-binding protein complexes using mRNA display. Nucleic Acids Res. 34, e27 (2006)

Doi, N., Kakukawa, K., Oishi, Y., Yanagawa, H.: High solubility of random-sequence proteins consisting of five kinds of primitive amino acids. Protein Eng. Des. Sel. 18, 279-284 (2005)

Doi, N., Kumadaki, S., Oishi, Y., Matsumura, N., Yanagawa, H.: In vitro selection of restriction endonucleases by in vitro compartmentalization. Nucleic Acids Res. 32, e95 (2004)

Horisawa, K., Tateyama, S., Ishizaka, M., Matsumura, N., Takashima, H., Miyamoto-Sato, E., Doi, N., Yanagawa, H.: In vitro selection of Jun-associated proteins using mRNA display. Nucleic Acids Res. 32, e169 (2004)

Yonezawa, M., Doi, N., Kawahashi, Y., Higashinakagawa, T., Yanagawa, H.: DNA display for in vitro selection of diverse peptide libraries. Nucleic Acids Res. 31, e118 (2003)

Kawahashi, Y., Doi, N., Takashima, H., Tsuda, C., Oishi, Y., Oyama, R., Yonezawa, M., Miyamoto-Sato, E., Yanagawa, H.: In vitro protein microarrays for detecting protein-protein interactions: Application of a new method for fluorescence labeling of proteins. Proteomics 3, 1236-1243 (2003)

Doi, N., Takashima, H., Kinjo, M., Sakata, K., Kawahashi, Y., Oishi, Y., Oyama, R., Miyamoto-Sato, E., Sawasaki, T., Endo, Y., Yanagawa, H.: Novel fluorescence labeling and high-throughput assay technologies for in vitro analysis of protein interactions. Genome Res. 12, 487-492 (2002)

Doi, N., Yanagawa, H.: Genotype-phenotype linkage for directed evolution and screening of combinatorial protein libraries. Comb. Chem. High Throughput Screen. 4, 497-509 (2001)

Doi, N., Yanagawa, H.: STABLE: protein-DNA fusion system for screening of combinatorial protein libraries in vitro. FEBS Lett. 457, 227-230 (1999)

Doi, N., Yanagawa, H.: Design of generic biosensors based on green fluorescent proteins with allosteric sites by directed evolution. FEBS Lett. 453, 305-307 (1999)

Copyright © Keio University. All rights reserved.